(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)

貨號：N30210

存儲條件：4-30℃

1、純化流程

1.1 Buffer 的準備

Buffer 可使用下列推薦Buffer，也可根據自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22μm 或者0.45μm濾膜過濾除菌。因為Ni NTABeads FF可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需Buffer 不同，具體配置方法見下表：

(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)可溶性組an酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方:

包涵體組an酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方：

1.2樣品準備

1.2.1細菌或酵母表達的蛋白

1、挑取單菌落到LB 培養(yǎng)基中，根據載體使用說明加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。

2、表達結束后，將培養(yǎng)液轉移到離心杯中，7,000rpm，離心15min 收集菌體，然后加入1/10 體積的 Lysis Buffer 和 PMSF，PMSF在破碎前加入，最終濃度為1mM。加入溶jun酶（工作濃度為0.2-0.4mg/ml，如果表達的宿主細胞內含pLysS 或pLysE，可以不加溶jun酶），（同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結合）。

3、將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10μg/ml RNase A 和5μg/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。

4、將澄清的破碎液轉移至離心管中，10,000rpm 下，4 度離心 20-30 分鐘。取上清，置于冰上備用或-20度保存。

1.2.2酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1、將細胞培養(yǎng)液轉移至離心杯，5000rpm 下，離心10min，收集菌體得上清，如上清中不含EDTA、組an酸和還原劑等物質，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、組an酸和還原劑等物質，需用1×PBS 4℃下透析才能加入柱子。

2、對于大量體積的上清，需加入硫酸氨沉淀濃縮后，蛋白還需用1XPBS 4℃透析后才能加入柱子。

1.2.3包涵體蛋白純化(變性條件)

1、將培養(yǎng)液轉移到離心杯中，7,000rpm，離心15min 收集菌體，去掉上清。

2、按照菌體：Lysis buffer=1:10(W/V)將菌體懸浮起來，混勻，冰浴超聲破碎。

3、將破碎液轉移至離心管中，10,000rpm下，4 度離心20-30 分鐘。去掉上清，步驟2）和 3）可以重復一次。

4、按照菌體:Lysis buffer(含8M 尿素)=1:10(W/V)將包涵體懸浮起來。

5、變性條件下進行His 標簽蛋白純化，具體緩沖液配方見表4。

1.3Ni NTABeads 6FF 的裝填

Ni NTA Beads 6FF 被廣泛應用于工業(yè)純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下面介紹使用 Ni NTA Beads 6FF 填裝層析柱的方法。

層析柱的裝填（使用儲液器裝填）

1、用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關閉柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去離子水。

2、將樹脂懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產生。

3、如果使用儲液器，應立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產生氣泡。

4、打開層析柱底部出口，開起泵，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個很好的裝填效果。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標上柱床高度。

5、關閉泵，關閉層析柱出口。

6、如果使用儲液器，去除儲液器，將分配器至于層析柱中。

7、將分配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭。

8、將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調整分配器。

1.4樣品純化

Ni NTA Beads 6FF裝填好后，可以用各種常規(guī)的中壓色譜系統(tǒng)，以ÄKTA 儀器使用為例介紹其使用方法。

1、將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口，將預裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2、用3-5 倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。

3、使用至少5 倍柱床體積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。

4、利用泵或注射器上樣。注：樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會導致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。

5、用Wash Buffer 沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）。注：在樣品和結合緩沖液中加入咪唑可以提高樣品純度。

6、用Elution Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常 5 倍柱體積洗脫液就足夠了。可以用一個小的梯度，例如 20 倍柱體積或更多，來分離不同結合強度的蛋白質。

1.5SDS-PAGE 檢測

將使用純化產品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE 檢測純化效果。

2、在位清洗

當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時，需要進行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗前，先把 Ni2+脫掉（參見3.填料再生），清洗結束后，將填料保存在 20%乙醇中，后者重新掛鎳再保存在20%乙醇中。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用30%異丙醇清洗 5-10 個柱體積，接觸時間為15-20分鐘可以去除此類污染物。然后，再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料 2 倍柱體積。例如，含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時間為 1–2 小時。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗 5 個柱體積，以徹di去除去污劑。最后使用10倍柱體積的去離子水清洗。

去除離子作用結合的蛋白

使用1.5M NaCl 溶液接觸時間為10-15分鐘清洗。然后再使用去離子水清洗10個柱體積。

3、填料再生

組an酸標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高，填料上面出現(xiàn)明顯的污染，或者填料載量明顯變低時，需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內，按照下面操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

3.1使用0.2 M 醋酸溶液（含6 M GuHCl）清洗 2 倍柱體積；

3.2使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.3使用2% SDS 清洗 3 倍柱體積；

3.4使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.5使用乙醇清洗5 倍柱體積；

3.6使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.7使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積；

3.8使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.9使用100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積；

3.10使用去離子水清洗10 倍柱體積；

填料再生后，可以立即使用，也可以保存在20%的乙醇中，置于 4°C 保存。