GFP-Nanoab-Magnetic Beads貨號(hào)：GNM-25-1000

儲(chǔ)存條件：可在 4℃保存半年，避免離心，干燥，長(zhǎng)時(shí)間保存可凍存。

產(chǎn)品描述：

偶聯(lián) anti-GFP 納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

沒(méi)有普通抗體的輕鏈和重鏈；

高親和力：解離常數(shù)達(dá)到 pM 級(jí)別；

高載量：20μl 的 slurry 可以結(jié)合 8-10μg GFP 蛋白；

較短的孵育時(shí)間，結(jié)合 5-30 min 即可；

應(yīng)用范圍：

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測(cè)定、質(zhì)譜分析等；

特異性

可以結(jié)合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等。

產(chǎn)品特性：

保存條件：可在 4℃保存半年，避免離心，干燥，長(zhǎng)時(shí)間保存可凍存。

存儲(chǔ)緩沖液：PBS(含有 20%乙醇)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

收集細(xì)胞：

每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（約一個(gè) 10 cm培養(yǎng)皿）表達(dá)綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基、向培養(yǎng)皿中加入 2ml預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，利用細(xì)胞刮或yi酶消化的方法收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管，500 g離心 3 分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨，盡 可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。加入 500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進(jìn)行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

細(xì)胞裂解：

1．用500μl 預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞，在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF（自備）。對(duì)于核/染色質(zhì)蛋白可使用 RIPA 裂解液中加入1 mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2，蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF（自備）。

2．把離心管放置在冰上 30 分鐘，可以每 10 分鐘充分吹打一次。

3．細(xì)胞裂解產(chǎn)物在 4℃，20,000 g 條件下離心 15 分鐘，轉(zhuǎn)移裂解產(chǎn)物到一個(gè)新的預(yù)冷管中，丟棄沉淀。注意：此時(shí)細(xì)胞裂解產(chǎn)物可以放在-80℃進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

平衡珠子：

4．振蕩混勻 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，吸取 40μl slurry 到 500 μl 預(yù)冷的裂解緩沖液中，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。（此步驟可選）

結(jié)合蛋白

5．將細(xì)胞裂解產(chǎn)物加入到平衡的 GFP-Nanoab -Magnetic Beads 中（如果未做第 4 步，可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl slurry），在 4 ℃冷柜中的旋轉(zhuǎn)混合儀上結(jié)合 30-60 min。如果需要，保存 50 μl 的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。

6. 在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。如果需要，保存 50 μl 上清液進(jìn)行免疫印跡分析。

清洗珠子：

7. 用 500 μl 預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸 GFP-Nanoab -Magnetic Beads，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液并重復(fù)洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。

洗脫蛋白

方法一：

加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重懸 GFP-Nanoab -Magnetic Beads。

在 95℃，10 min 條件下，加熱 GFP-Nanoab -Magnetic Beads，把免疫沉淀復(fù)合物從珠子上游離出來(lái)。GFP-Nanoab -Magnetic Beads 可在磁力架上進(jìn)行分離，收集的產(chǎn)物可以進(jìn)行 SDS–PAGE 分析。

方法二：

替代步驟 8 和 9 的可選步驟：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白，建議孵育時(shí)間 30 秒，并不斷混勻，隨后用磁力架進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移上清液到新管中，為了中和酸性的gan氨酸，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。

可選方案

方案一：

如需進(jìn)行 GFP 融合酶的活性檢測(cè)，無(wú)需洗脫，可以直接檢測(cè)。

方案二：

如需進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP） 實(shí)驗(yàn)，主要用于含有 GFP 融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA 相互作用的實(shí)驗(yàn)。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA 的純化以及 DNA 的鑒定。其中前期細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂不變；然后接著直接進(jìn)入說(shuō)明書(shū)的第 5 步，加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物后，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到 GFP-Nanoab -Magnetic Beads上；進(jìn)入第 6 和 7 步，分離得到復(fù)合物；進(jìn)入第 10 步，得到洗脫的復(fù)合物；后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA 的純化及 DNA 的鑒定等同于普通的 ChIP 實(shí)驗(yàn)。RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)步驟同上。

方案三：

GFP-Nanoab -Magnetic Beads 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測(cè)和驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復(fù)合物后，然后進(jìn)行 SDS–PAGE 分析，用考馬斯亮藍(lán)或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。