貨號(hào)：CB0234

存儲(chǔ)條件：-20oC保存，一年有效。Protein A/G Agarose Beads 4oC保存（不可-20℃凍存）。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

本免疫沉淀試劑盒適合用于無(wú)標(biāo)簽蛋白、內(nèi)源性蛋白等的下拉富集實(shí)驗(yàn)。試劑盒包含實(shí)驗(yàn)所需各種緩沖液，Protein A/G agarose beads 配合客戶(hù)自配的特異性抗體便捷快速的完成免疫沉淀或者免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)過(guò)程。本試劑盒適用于動(dòng)物細(xì)胞樣品的免疫沉淀過(guò)程，試劑盒中的緩沖液配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化可以充分裂解細(xì)胞樣本，有利于蛋白的釋放和后續(xù)IP/Coip實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。試劑盒提供的Normal Rabbit/mouse IgG可作為陰性對(duì)照排除beads的非特異性結(jié)合，如IP一抗為其他來(lái)源則需選擇與之來(lái)源相同的IgG作為對(duì)照。

使用說(shuō)明：

1. 蛋白提取

1.1 懸浮細(xì)胞樣本

250-1000×g室溫離心5min收集細(xì)胞。如必要可使用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)胞盡量分散開(kāi)?？蓞⒖济?-10x105細(xì)胞加入100-200μl的比例加入的動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液（用之前按照1:100比例添加Protease Inhibitor Cocktail (100X)）。輕彈管底或適當(dāng)吹打，以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，建議分裝成5-10x105細(xì)胞/管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。充分裂解后，10,000-14,000×g在4oC 離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。

注：裂解后會(huì)出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會(huì)產(chǎn)生沉淀物。

1.2 貼壁細(xì)胞樣本

吸除培養(yǎng)液。如有必要，用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。按照每5-10x105細(xì)胞(相當(dāng)于6孔板的一個(gè)孔)加入100-200μl的動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液（用之前按照1:100比例添加Protease Inhibitor Cocktail (100X)），適當(dāng)吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸動(dòng)物細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。植物細(xì)胞宜在冰上裂解2-10min。充分裂解后，10,000-14,000×g在4oC 離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后會(huì)出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會(huì)產(chǎn)生沉淀物。

1.3 檢測(cè)蛋白提物中的蛋白濃度。并留存少量樣本用于Input對(duì)照。

2免疫沉淀/共沉淀實(shí)驗(yàn)

2.1 瓊脂糖珠清洗

瓊脂糖珠存儲(chǔ)在保護(hù)液中，使用前需要充分清洗。重懸混勻protein A/G瓊脂糖珠后取適量混懸液（如總體積100ul，beads含量為25ul，吸取beads時(shí)建議用剪刀減去槍尖部分），添加漂洗緩沖液或植物裂解緩沖液至500ul，輕輕混懸吹打protein A/G瓊脂糖珠，6000g 4℃離心30s，小心去除上清，不要吸到凝膠。重復(fù)以上步驟2-3次。

2.2 protein A/G 瓊脂糖與抗體結(jié)合

（1）抗體稀釋?zhuān)喊凑湛贵w說(shuō)明書(shū)的建議稀釋抗體至工作濃度，或者配成終濃度為5-50ug/ml的抗體工作液，置于冰上備用。

（2）陰性對(duì)照設(shè)置：稀釋試劑盒中帶的與抗體來(lái)源相同的IgG，如一抗來(lái)源為Rabbit，則選Normal Rabbit IgG，稀釋為與上一步抗體同樣的濃度作為正常IgG工作液，用于陰性對(duì)照或者降低背景；

（3）抗體吸附：將2.1 步驟清洗完的protein A/G瓊脂糖珠6000g 4℃離心30s，并吸除上清，加入100ul抗體工作液或IgG 工作液（目的抗體和IgG吸附可各做一組），重懸后室溫在翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育15min-1h。

（4）洗滌：孵育完抗體后添加500ul 漂洗緩沖液，移液器輕輕吹打懸浮 protein A/G 瓊脂糖珠，冰浴并置于搖床上5min，然后6000g 4℃ 離心30s，小心去除上清。重復(fù)此步驟3次。

（5）（可選）將洗滌后的protein A/G瓊脂糖珠與樣品在4℃孵育1小時(shí)后離心分離，以去除與IgG有非特異性結(jié)合的蛋白。

（6）取20ul吸附好抗體（目的抗體與IgG組各做一組）的protein A/G 瓊脂糖珠添加到100ul蛋白樣品中，置于搖床或者翻轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2-4h或者4℃過(guò)夜孵育。孵育結(jié)束后，6000g 4℃ 離心30s，小心去除上清。可保留部分上清用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)效果。

（7）洗滌：向（6）中去除上清的管子中添加500ul的漂洗緩沖液，吹打清洗瓊脂糖珠，并重復(fù)清洗3-5次。此步驟同時(shí)可向漂洗緩沖液中按照1:100的比例添加C0101 蛋白酶抑制劑，以減少蛋白的降解。

2.3 洗脫

酸洗脫：向清洗干凈的protein A/G 瓊脂糖珠（20ul）中添加50ul 洗脫緩沖液，吹打混勻后在搖床或者翻轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5min，孵育時(shí)間不建議太長(zhǎng)，最長(zhǎng)不超過(guò)15min。

孵育結(jié)束后6000g 4℃ 離心30s，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中并添加5ul 中和緩沖液。為提高洗脫效率，洗脫步驟可重復(fù)1-2次。洗脫后的蛋白可在-20或-80長(zhǎng)期保存，或者借用于后續(xù)檢測(cè)分析。

變性洗脫：后續(xù)不用于其他檢測(cè)分析的話(huà)，可使用變性洗脫的方式，在洗滌獲得的protein A/G瓊脂糖珠中添加50ul 2*loading buffer ，95℃加熱5-10min。6000g 4℃ 離心30s，取上清可用于SDS-PAGE或WB檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒中提供的洗脫方式為酸洗脫，如不需回收beads也可添加 loading buffer 進(jìn)行煮樣洗脫。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如涉及到磷酸化修飾或乙?；鞍祝瑒t需要添加磷酸酶抑制劑或去乙?；种苿?/span>。

3. Beads使用前應(yīng)保證充分混勻，混勻方式不建議劇烈渦旋震蕩。

4. 本產(chǎn)品僅限專(zhuān)業(yè)人員科學(xué)研究使用，不可用于臨床診斷或者治療，不可存放于普通住宅內(nèi)。

5. 為了您的安全健康，請(qǐng)穿戴一次性手套操作。